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检测原料 PCR
- 产品介绍
- 相关资料
产品说明
热启动DNA聚合酶是典型的B家族聚合酶，具有独特的结果，通过对NM聚合酶的分子改造，使得NM聚合酶尿嘧啶的结合能力失活，因而可以高效扩增亚硫酸氢盐处理过DNA或者含有尿嘧啶的文库。该酶显示出了与NM热启动DNA聚合酶相同的高产量、低GC偏差和覆盖均一性。NM 2X Mix for NGS 有5′-3′持续合成活性和3′→5′外切核酸酶（校正）活性，可用于含有尿嘧啶的模板扩增或者含有尿嘧啶的文库扩增。
产品信息
货号 | 规格 |
EQT021-01 | 1 mL |
EQT021-02 | 5 mL |
储存条件：-20℃保存。
操作方法
在打开前，仔细混匀并离心所有试管，以确保均匀。
推荐冰上配制反应体系，将该体系快速转移到98°C预热的PCR中。请参考以下反应。
以50 μL反应体系为例。
组份 | 50 µL | 终浓度 |
NM 2X Mix for NGS | 25 µL | 1× |
上游引物 (20 µM ) | 1-2 µL | 0.4-0.8 µM |
下游引物 (20 µM ) | 1-2 µL | 0.4-0.8 µM |
DNA模板* | Variable | |
Nuclease-Free Water | to 50 µL | N/A |
*此处模板指的是含有尿嘧啶模板或者文库
注意：温和混匀反应体系，如果必要可以通过短暂快速离心将试剂收集到管底。若用户使用无热盖的PCR仪，可以在反应体系表面覆盖一层矿物油。
*，注： 不同DNA模板最佳反应浓度不同，可参考PCR基本原则。
推荐PCR反应体系
推荐的PCR反应程序如下
步骤 | 温度 | 时间 | 循环数 |
预变性 | 98 °C | 45 s | 1 |
变性 | 98 °C | 10 s | 根据投入量，推荐循环数 |
退火 | 55-65 °C | 30s-1 min | |
延伸 | 72 °C | 30-60 s/kb | |
终延伸 | 72 °C | 1-5 min | 1 |
Hold | 4-12 °C | ∞ | 1 |
根据投入量选择不同的循环数
Input Bisulfite gDNA | PCR循环数推荐 |
5ng | 15-16 |
25ng | 11-12 |
50ng | 9-10 |
100ng | 8-9 |
200ng | 7-8 |
Input FFPE DNA | PCR循环数推荐 |
5ng | 16-17 |
25ng | 12-13 |
50ng | 10-11 |
100ng | 9-10 |
200ng | 8-9 |
Input cfDNA | PCR循环数推荐 |
10ng | 16-17 |
产品应用
1.亚硫酸氢盐转化的DNA的扩增
亚硫酸氢钠处理将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不会被转化。在随后的PCR扩增过程中，胸腺嘧啶替换尿嘧啶，使得可以通过测序将DNA甲基化精确到碱基对水平。NM 2X Mix for NGS聚合酶能够提供高产量的亚硫酸氢盐转化的DNA，并可进行稳定扩增。
2.扩增受损的DNA样本
胞嘧啶脱氨作用会在一段较长的时间内自行发生，温度升高时脱氨速度加快，并导致DNA和游离核苷酸中尿嘧啶的累积。当其他校正酶无效时，NM 2X HS Master Mix聚合酶可以从含有尿嘧啶的受损DNA模板中进行高保真扩增。